Доктор.ру

Научно-практический медицинский рецензируемый журная

д.б.н. Ж.И. Глинкина
Академик РАН, профессор, д.м.н. М.А. Курцер
д.м.н., И.В. Будник

Исследование хромосомной патологии в клетках неразвивающегося хориона методом высокопроизводительного секвенирования.

Резюме

• Цель исследования: Определить частоту и структуру хромосомных нарушений методом высококопроизводительного секвенирования (NGS) в клетках неразвивающегося хориона.
• Материалы и методы. 197 образцов хориона и 2 образца ткани мышцы плода, полученных от женщин в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 34,3 года). Диагностика проводилась методом высокопроизводительного секвенирования (NGS).
• Результаты. Хромосомная патология была обнаружена в 122 образцах из 199, что составило 61,3%. Анеуплоидия по одной хромосоме была представлена в 100 наблюдениях; патология с вовлечением двух хромосом - в 7; триплоидный набор в 9. По данным исследования трисомия хромосом занимает лидирующее место- 76%. Моносомии в основном были представлены недостачей одной из половых хромосом. Чаще патологические изменения наблюдали по хромосомам 16, 22 и одной из половых хромосом.
• Заключение. На основании полученных результатов можно сделать заключение, что метод NGS зарекомендовал себя как высокоэффективный современный метод для диагностики анеуплоидий и может быть предложен не только для исследования клеток неразвивающегося хориона, но и в качестве профилактического метода при проведении пренатальной диагностики.
• Ключевые слова: NGS, высокопроизводительное секвенирование, невынашивание беременности, неразвивающаяся беременность.

ВВЕДЕНИЕ

Частота невынашивания от всех желанных беременностей в популяции на протяжении многих лет составляет 15-25% [1, 2, 3]. Изучение кариотипа у неразвивающихся плодов проводят с целью выяснения причин невынашивания беременности. В настоящее время знания о хромосомном наборе спонтанных абортусов могут быть полезными при выборе последующей тактики лечения этих пациентов.

Основной процент (75-80%) прерываний беременности приходится на I триместр. В основе невынашивания беременности у этого контингента лиц могут лежать как генетические отклонения в эмбрионе, так и многоплодие, хронические инфекции, анатомические особенности матки, гормональные нарушения и т.д.

По данным литературы, в популяции до 50-60% ранних выкидышей связаны с хромосомными аномалиями. Многие авторы утверждают, что спонтанные аборты до 12 недель беременности являются хорошим индикатором генетических нарушений в эмбрионе [4, 5, 6, 7,8]. Несмотря на то, что к настоящему времени проведена серия масштабных цитогенетических исследований клеток спонтанных абортусов, существует ряд данных, противоречащих друг другу, касающихся частоты и спектра хромосомных нарушений у эмбрионов при неразвивающихся беременностях.

Молекулярные методы исследования хромосомной патологии в различных тканях находят все большее применение в диагностике [5]. Это связано с тем, что для данного метода нет необходимости культивировать клетки. Классическим цитогенетическим методом не всегда удается получить результат исследования. Зачастую это связано с низкой пролиферацией или ее отсутствием в исследуемых клетках.

Цель исследования

Определить частоту и структуру хромосомных нарушений методом высококопроизводительного секвенирования (NGS) в клетках хориона неразвивающихся беременностей.

Материал и методы

Контрольным материалом служили клетки хориона с известной патологией (была проведена предварительная пренатальная диагностика), полученные хирургическим путем в ходе прерывания беременности по желанию пациентки. Во всех случаях результаты цитогенетического исследования совпали с результатами секвенирования. Образцы, полученные от неразвивающихся беременностей, доставляли в лабораторию в изотоническом физиологическом растворе при температуре +4С. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из клеток хориона или мышцы плода. Всего было исследовано 197 образцов хориона и 2 образца ткани мышцы плода, полученных от женщин в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 34,3 года). 5 образцов были проанализированы дополнительно из высушенного хориона на специализированных картах для сбора биологических образцов производства компании АлкорБио, г. Санкт-Петербург (фото карты представлено на рис. 1, результаты представлены на рис.2) . Средний срок прерывания беременности составил 8,5±2,1 недель (от 5 до 16 недель).

Рисунок 1. Расположение хориона на специализированной карте для хранения биологического материала.

А)

Б)

Рисунок 2. Результат исследования клеток неразвивающегося хориона, взятого из физического раствора (А) и высушенного на специализированной карте (Б). Выявлена трисомия хромосомы 16.

ДНК из клеток получали стандартным методом для выделения ДНК наборами компании Promega (USA). Секвенирование проводили согласно технологии Illumina на приборе Miseq. Данные, полученные прибором обрабатывали с помощью программного обеспечения BlueFluse Multi.

Полученные данные

Хромосомная патология была обнаружена в 122 образцах из 199, что составило 61,3%. Частота патологии у женщин разного возраста представлена в таблице 1.

Таблица 1.
Частота хромосомной патологии в клетках хориона у женщин в различных возрастных группах

Возрастная группа женщин	% выявленной патологии
До 35 лет	55,6%
35-40 лет	60,0%
Старше 40 лет	72,0%

Анеуплоидия по одной хромосоме была представлена в 100 наблюдениях. Патология с вовлечением двух хромосом была отмечена в 7 наблюдениях, триплоидный набор в 9 случаях. Сочетание анеуплоидии с мозаицизмом были выявлены в 6 наблюдениях табл. 2.

Таблица 2.
Количество патологических изменений (все возрастные группы)

Кол-во хромосом, вовлеченных в патологию	Частота встречаемости (%)
1 хромосома	82
2 хромосомы	5,7
Сочетание анеуплоидии с мозаицизмом	4,9
Триплоидный хромосомный набор	7,4

По частоте встречаемости, трисомия хромосом занимает лидирующее место- 76%. Моносомии в основном были представлены недостачей одной из половых хромосом (15 наблюдений). Только в одном наблюдении моносомия была представлена хромосомой 21. Структура хромосомной патологии представлена на рисунке 3.

Рисунок 3. Структура хромосомной патологии, выявленная методом NGS.

Дупликации/делеции (рис. 4) и мозаицизм были выявлены в одинаковом проценте случаев - 4%. Наиболее часто патологические изменения наблюдались по хромосомам 16, 22 и одной из половых хромосом (20%, 12,9% и 17,1%, соответственно).

А)

Б)

В)

Рисунок 4. Результат исследования клеток неразвивающегося хориона. Выявлено 4 копии короткого плеча хромосомы 4 (А), выявлена трисомия хромосомы 22 (Б), выявлена недостача генетического материала, соответствующего одной из половых хромосом (В).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты нашего исследования показали, что у женщин старше 40 лет, более чем в 70 % наблюдений выявлены хромосомные нарушения. Высокий процент генетической патологии у этой категории пациентов был отмечен и другими авторами [4,5]. Анализ сравнения кариотипа у абортусов женщин различных возрастных групп позволил обнаружить увеличение частоты хромосомной патологии от возраста женщин. Золотухина Т.В. с соавт. (2003, [9]) также отметили зависимость повышения уровня хромосомных изменений в абортусах от возраста женщин. Результаты анализа показали, что у пациенток в возрасте от 20 до 30 лет преобладали абортусы с нормальным кариотипом; в возрасте от 31 до 40 лет - превалировали плоды с хромосомными аберрациями; в возрасте старше 40 лет - все плоды имели аномальный кариотип.

Другие авторы сделали заключение, что у пациенток старше 40 лет в 82% случаях потеря беременности может быть связана с изменениями в кариотипе у эмбриона [3].

Низкий уровень выявленной моносомии указывает на то, что эмбрионы с такой патологией имеют низкий потенциал развития. В структуре моносомий, отсутствие одной из половых хромосом занимает почти 100%

Анеуплоидии в клетках хориона одновременно по 2 хромосомам, делеции/дупликации встретились достаточно редко, что тоже указывает на то, что данная патология может оказывать негативное влияние на потенциал развития эмбриона.

Полученные данные указывают на то, что необходимо обращать внимание на возраст пациенток при планировании беременности, как при естественном зачатии, так и при проведении программы ВРТ. Женщинам с бесплодием за 35 лет необходимо предлагать проведение программы ЭКО с преимплантационным скринингом эмбрионов на анеуплоидии. Перенос одного здорового эмбриона, не только позволит родить ребенка без патологии, но и предупредить прерывание беременности больным плодом, что может негативно сказаться на физическом и психическом здоровье женщины.

Полученные нами идентичные профили при исследовании свежего и высушенного на карте материала, полученные однозначные результаты, указали на то, что клетки высушенного хориона на карте для хранения биологического материала не оказывают влияние на результат анализа и карты могут быть использованы для хранения материала, в тех случаях, когда невозможна его транспортировка в ближайшее время.

Исследование клеток неразвивающегося хориона может внести большой вклад в понимание процесса мейоза и, что не маловажно, будет способствовать разработке новых профилактических мероприятий, предотвращающих невынашивание беременности как при естественном зачатии, так и в рамках программы ВРТ.

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что метод NGS зарекомендовал себя как высокоэффективный современный метод для диагностики анеуплоидий и может быть предложен не только для исследования клеток неразвивающегося хориона, но и в качестве профилактического метода при проведении пренатальной диагностики.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

• Тишкевич, О.Л. Невынашивание беременности после ЭКО и ЭКО/ИКСИ / О.Л. Тишкевич, С.В.Жуковская, С.Б. Шелег и др. // Пробл. репрод. - 1998 - № 6 - с. 21
• Gissier, Mika, Silverio, Maili Malin, Heminki, Elina. In-vitro Fertilisation pregnancies perinatal health in Finland 1991–1993 / Gissier, Mika, Silverio, Maili Malin, Heminki, Elina // Hum. Reprod. – 1995 – vol. 10 - № 7 – p. 1856–1861.
• Spandorfer, S.D., Davis, O.K., Barmat, L.I. et al. Relationship between maternal age and aneuploidy in in vitro fertilization pregnancy loss / Spandorfer, S.D., Davis, O.K., Barmat, L.I. // Fertil. Steril. – 2004 – vol. 81 - № 5 – p. 1265 - 1269.
• Page JM, Silver RM. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss // Clin Obstet Gynecol, 2016, 59(3), 498-508
• Sahoo T, Dzidic N, Strecker MN, Commander S, Travis MK, Doherty C, Tyson RW, Mendoza AE, Stephenson M, Dise CA, Benito CW, Ziadie MS, Hovanes K. Comprehensive genetic analysis of pregnancy loss by chromosomal microarrays: outcomes, benefits, and challenges // Genet Med., 2017, 19(1), 83-89
• Назаренко, С.А. Структура хромосомных нарушений у 552 спонтанных абортусов томской популяции / С.А. Назаренко, Н.Н.Суханова, И.Н. Лебедев и др. // Молекулярно- биологические технологии в медицинской практике –Новосибирск - Альфа Виста - 2005- вып. 7 - с. 158-165.
• Govaerts, I., Koenig, I., Van den Bergh, M., Bertrand, E., Revelard, Ph., Englert, Y. Is intracytoplasmic sperm injection (ICSI) a safe procedure? What do we learn from early pregnancy data about ICSI? / Govaerts, I., Koenig, I., Van den Bergh, M., Bertrand, E., Revelard, Ph., Englert, Y. // Hum. Reprod. – 1996 – vol. 11 - № 2 – p. 440 - 443.
• Martin, R.H. The risk of chromosomal abnormalities following ICSI / Martin, R.H. // Hum. Reprod. – 1996 – vol. 10 - № 7 – p. 924 – 925.
• Золотухина, Т. В. Комплексное обследование в семьях с неразвивающимися беременностями, наступившими в результате вспомогательных репродуктивных технологий / Т. В. Золотухина, И.И. Витязева, В.М. Здановский и др. // Методические рекомендации – 2003 - № 51 - 17 с.