Вестник Росздравнадзора
Рецензируемый научно-практический журнал для специалистов в сфере здравоохранения и фармдеятельности
Ж.И. ГЛИНКИНА, М.А. КУРЦЕР, Е.С. МЛАДОВА, М.М. ОВЧИННИКОВА, А.Ю. ВЫСОЦКИЙ, И.Д. ТРОЦЕНКО
Использование высокопроизводительного секвенирования (NGS) в целях профилактики хромосомной патологии в программе ВРТ
Профилактике хромосомных заболеваний в настоящее время уделяется большое внимание в связи с достаточно широкой распространенностью данной патологии.
На данный момент насчитывают около 800 вариантов хромосомных аномалий, связанных с изменением числа хромосом или их структуры.
Нарушение хромосомного набора у эмбриона/плода может являться причиной остановки развития беременности, а также приводить к самопроизвольному ее прерыванию. Следует отметить, что риск рождения ребенка с хромосомной патологией возрастает с возрастом матери старше 35 лет. Изменение репродуктивного поведения человека (зачастую возраст перворожениц стал превышать 35 лет) требует новых подходов к разработке профилактики врожденной и наследственной патологии у потомства. Особенно это актуально у пациентов программы ВРТ, у которых нарушения в кариотипе встречаются в разы чаще, чем в популяции.
Профилактические мероприятия в рамках вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) сводятся к селекции и переносу единственного здорового эмбриона в полость матки. Это стало возможным с введением в практику преимплантационной генетической диагностики/скрининга (ПГД/ПГС).
То, что перенос эмбрионов без хромосомных аномалий в разы увеличивает уровень имплантации, вынашивания беременности, уже не вызывает ни у кого сомнений. Yang Z. с соавт. [5] в своей работе рекомендует
предварительно проводить ПГС и селективно переносить как можно меньше эмбрионов с учетом возраста, анамнеза и проведенных ранее циклов. Перенос только одного эмбриона после ПГС дал беременность в 70,9% случаев.
Современный метод высокопроизводительного секвенирования (NGS — Next Generation Sequencing), более четко указывает не только на анеуплоидии, но и на наличие делеций/дупликаций, мозаицизма, что позволяет выбрать более четко здоровые эмбрионы для переноса. Принцип метода NGS принципиально отличается от других методов ПГС. Данный метод основан на определении последовательности нуклеиновых кислот.
Этот метод в последнее время все больше вытесняет другие методы ПГС и находит более широкое применение в клиниках ВРТ за рубежом. Публикации разных исследователей доказывают преимущества применения NGS по сравнению с другими методами.
Так Yueqiu Tan с соавт. [4] показали, что оба метода — NGS и SNP — обеспечивают сравнимую точность и эффективность у эуплоидных эмбрионов. Однако в семи случаях результаты NGS и SNP не совпали среди анеуплоидных образцов. Дополнительный анализ проводился с использованием метода QF-PCR (quantitative fluorescence polymerase chain reaction). При сравнительном анализе по результатам SNP, которые по данным были точно дифференцированы, было выявлено два ложноположительных и четыре ложноотрицательных эмбриона. Трисомия по Y хромосоме также была выявлена с использованием метода NGS, но не SNP (single nucleotide polymorphism) [4].
О том, что метод NGS более надежен в плане преимплантационного скрининга, показали и другие авторы. Francesco Fiorentino с соавт. [1], проводя сравнительный анализ эмбрионов методами NGS и CGH (array comparative genomic Hybridization), показали, что некоторые анеуплоидии хромосом, которые были выявлены методом NGS и потом были подтверждены методом QF-PCR, не были обнаружены методом CGH [1]. Более высокий уровень мозаицизма (на 24,6%) показал повторный анализ (р < 0,05) методом NGS эуплоидных бластоцист после неэффективного переноса [6].
Цель исследования
Определить частоту и структуру хромосомных нарушений методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) у эмбрионов, полученных в программе ВРТ.
Материал и методы
Материалом для исследования служили биопсированные клетки трофэктодермы от эмбрионов 5 суток развития. В исследование было включено 750 эмбрионов, полученных от 245 пациенток в возрасте от 22 до 49 лет (средний возраст 35,9 года). Все эмбрионы были получены оплодотворением методом ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку, Intra Cytoplasmic Sperm Injection — ICSI). В исследование были взяты супружеские пары с нормальным кариотипом.
Стимуляцию суперовуляции проводили согласно стандартным протоколам в зависимости от индивидуальных особенностей женщины и гормонального профиля.
Преимплантационный генетический скрининг проводили согласно технологии Illumina на приборе Miseq. ДНК из клеток трофэктодермы получали методом полногеномной амплификации. Данные, полученные прибором, обрабатывали с помощью программного обеспечения BlueFluse Multi.
Таблица 1
Частота патологии в различных возрастных группах
Возрастная группа | Эмбрионов с патологией (%) |
---|---|
До 35 лет | 142 из 278 (51,1%) |
35—40 лет | 159 из 257 (61,9%) |
Старше 40 лет | 166 из 215 (77,2%) |
Таблица 2
Количество патологических изменений у эмбриона в разных возрастных группах
Кол-во пат. хромосом | До 35 лет | 35-40 лет | Старше 40 лет |
---|---|---|---|
1 хромосома | 50,8% | 48,1% | 32,1% |
2 хромосомы | 15,8% | 27,1% | 23,3% |
Более 2 хромосом | 33,4% | 24,8% | 44,6% |
Таблица 3
Структура генетических изменений в различных возрастных группах
Тип патологии | До 35 лет | 35—40 лет | Старше 40 лет |
---|---|---|---|
Моносомия | 20,4% | 23,6% | 32,8% |
Трисомия | 16,2% | 22,1% | 41,2% |
Делеции/дупликации | 17,9% | 10,9% | 4,2% |
Мозаицизм | 45,5% | 43,4% | 21,8% |
Полученные данные
Полногеномная амплификация клеток трофэктодермы была проведена согласно протоколу Illumina. Наличие контаминации и анализ качества полученной ДНК проводили с помощью электрофореза.
Анализ секвенирования показал, что в 467 образцах из 750 (62,3%) была выявлена генетическая патология. Количество эмбрионов с патологией в разных возрастных группах представлено в таблице 1.
Частота эмбрионов с патологией в группе 35—40 лет была статистически значимо выше по сравнению с группой до 35 лет (р = 0,0107), а в группе старше 40 лет частота патологии статистически значимо была выше по сравнению с группой 35—40 лет (р = 0,0005).
Анализ количества вовлеченных в патологию хромосом показал, что изменения одной хромосомы встречались в 43,3% наблюдений; двух в 22,2%; более 2 хромосом в 34,5% (табл. 2).
Частота патологии, представленной более чем по 2 хромосомам в группе старше 40 лет, была статистически значимо выше по сравнению с группами до 35 лет (р = 0,0068) и 35—40 лет (р=0,0001) (рис. 1).
Детальный анализ результатов показал, что частота встречаемости патологии (моносомия, трисомия, делеции, дупликации, мозаицизм) хромосом 15, 16, 21, 22 была выше по сравнению с другими хромосомами (табл. 3).
Частота трисомий различных хромосом составила 16,2% в возрастной группе до 35 лет, 22,1% в группе 35—40 лет и 41,2% в возрастной группе старше 40 лет. В последней группе частота трисомий была статистически значимо выше по сравнению с другими возрастными группами (p < 0,01). При сравнении частоты трисомии в группах до 35 лет и 35—40 лет статистически значимых отличий получено не было.
Изучение уровня мозаицизма (рис. 3) показало, что наиболее высокий уровень был отмечен в возрастной группе до 35 лет и составил 45,5% (р < 0,01), в возрастной группе 35—40 лет составил 43,4%. В группе женщин за 40 лет уровень не превышал 21,8%.
Особый интерес представляет изучение в клетках трофэктодермы делеций и дупликаций. Частота делеций/дупликаций (рис. 2) была наиболее высокой в возрастных группах до 35 лет 17,9% и 35—40 лет 10,9% по сравнению с группой старше 40 лет (4,2%, р < 0,05).
Обсуждение полученных данных
Многочисленными работами доказано, что нарушения репродуктивной функции могут быть обусловлены как хромосомными нарушениями, генными мутациями у самих родителей, так и возникновением в их половых клетках мутаций de novo.
Вышесказанное указывает на необходимость проявлять настороженность при использовании методов ВРТ у таких супружеских пар с генетическими особенностями.
Результаты исследования ПГС всех исследователей показывают высокий процент анеуплоидий у преимплантационных эмбрионах и этот процент зависит от возраста женщин [2, 3]. По нашим данным, у женщин старше 40 лет процент анеуплоидных эмбрионов составляет 77,2%.
В наших исследуемых группах помимо различного процента генетической патологии, структура генетической патологии также отличалась. Трисомии встречались чаще в группе женщин за 40 (41,2%), а мозаицизм и делеции/дупликации чаще встречались в группах женщин до 40 лет. Эти пациентки должны обязательно пройти медико-генетическое консультирование и быть предупреждены о высоком риске возникновения в эмбрионах генетической патологии.
Как было показано выше, метод NGS позволяет четко диагностировать делеции, дупликации и мозаицизм у эмбрионов. Обнаружение данной патологии требует новых подходов к консультированию пациентов врачом-генетиком. Врач должен свободно владеть базами данных, в которых собрана информация о значении генетических изменений, и знать роль тех или иных обнаруженных вариаций в биологических процессах.
Вышесказанное указывает на то, что преимплантационная генетическая диагностика методом NGS является на сегодняшний день самым точным методом по выявлению хромосомных аномалий у эмбрионов и может быть использована как профилактическое мероприятие по невынашиванию беременности и рождению больного ребенка в рамках программы ВРТ.
ИСТОЧНИКИ